• Séquençage

Séquençage 

Quantité

Vous envoyez au laboratoire :
Format d'expédition / commentaires

Plasmides ( par multiples de 8 )

(avec votre amorce spécifique  inclue)

200 - 300ng plasmide

0.5µl d'amorce à 10µM

 qsp 7µl final

 (compléter avec H2O ultra-pure)

Barrettes de 8 puits, Applied Biosystems  Micro AmpTM

ou

Au delà de 4 barrettes, utilisez des plaques Applied Biosystems MicroAmp TM optical (Applied Biosystem, réf : N801-0560).



Plasmides (Par multiple de 8 avec une même amorce)

(sans amorce de séquençage incluse, si l'amorce universelle est fournie par la plate-forme)

Voir  liste des amorces


200 - 300ng plasmide

qsp 6.5 µl final

(compléter avec H2O ultra-pure)

Barrettes de 8 puits, Applied Biosystems  Micro AmpTM

ou

Au delà de 4 barrettes, utilisez des plaques Applied Biosystems MicroAmp TM optical (Applied Biosystem, réf : N801-0560).

Nous fournir les amorces dans des tubes à part. (type eppendorf)

Prévoir  1µl d'amorce à 10µM par réaction de séquence.

Produits de PCR purifiés (Exosap)

(avec amorce spécifique inclue)
5µl de produit de PCR purifié (Purification Exosap selon protocole plate-forme) par séquence


0.5 µl d'amorce à 10µM


Volume final= 5.5µl


Barrettes de 8 puits, Applied Biosystems  Micro AmpTM

ou

Au delà de 4 barrettes, utilisez des plaques Applied Biosystems MicroAmp TM optical (Applied Biosystem, réf : N801-0560).

Produits

de PCR bruts

(sans amorce)

  (Par multiple de 8 avec une même amorce)

Prévoir 5µl de produit de PCR par séquence.

!!! Joindre la photo du gel de migration des produits de PCR et du marqueur de taille en indiquant la concentration et le volume utilisé lors du dépôt.

Barrettes de 8 puits, Applied Biosystems  Micro AmpTM

ou

Au delà de 4 barrettes, utilisez des plaques Applied Biosystems MicroAmp TM optical (Applied Biosystem, réf : N801-0560).

 Attention ! Ces produits PCR ne doivent contenir ni BSA, ni DMSO, ni huile.

 Ne pas rajouter l'amorce dans les échantillons. Nous fournir les amorces dans des tubes à part. (type Eppendorf)

 Prévoir  1µl d'amorce à 10µM par réaction de séquence.

Réactions de séquences non purifiées

(réalisées par vos soins  avec le Kit ABI Big-Dye V3.1 ou V1.1)

Plaque 96 puits :

10 µl réactions de séquence non purifiées

Plaques Applied Biosystems MicroAmp TM optical (Applied Biosystem, réf : N801-0560)

 Envoi par multiple de 48

(Si autre format, contacter le personnel de la plateforme)

Réactions de séquences purifiées

(réalisées par vos soins  avec le Kit ABI Big-Dye V3.1 ou V1.1)

Plaque 96 puits :

10 µl réactions de séquence purifiées

 Plaque 384 puits :

5 µl réactions de séquence purifiées

Plaques Applied Biosystems MicroAmp TM optical

(Applied Biosystem, réf : N801-0560)

 Envoi par multiple de 48

 Indiquer votre méthode de purification



Si vous avez plusieurs demandes de séquençage à faire dans la même semaine, vous devez regrouper vos échantillons dans un même  envoi.

Dans le cas, ou vous auriez à déposer le même jour, des produits à séquencer de types différents ( produits de PCR et plasmides), il s'agit de deux demandes distinctes. En conséquence, vous devez :

Placer les échantillons dans des barrettes ou des plaques séparées.

Prévoir 1 mail associé à « une fiche d'accompagnement » et « une feuille de route » pour chaque type de produit à séquencer.

  •   Amorces disponibles sur la plate-forme :
 Nom Séquence (5'>3')
 SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG
 CMV CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG
 CMV Pro for
 ATG GGC GGT AGG CGT G
 T7 PROM
 TAA TAC  GAC TCA CTA TAG GG
 T7 TERM
 GCT AGT TAT TGC TCA GCG G
 M13 rev
 CAG GAA ACA GCT ATG ACC
 EBRV-R GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC
 p-REP-F GCT CGA TAC AAT AAA CGC C
 T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA
 V5 (C-TERM)
 ACC GAG GAG AGG GTT AGG GAT
 IRES rev
 CCT CAC ATT GCC AAA AGA CG
 SV40pro_F TAT TTA TGC AGA GGC CGA GG
 M13F TGT AAA ACG ACG GCC AGT

  • OPTION
Si vous le souhaitez, nous vous proposons de mesurer la concentration de vos solutions plasmidiques sur spectrophotomètre (NanoDrop® ND-1000)

  • Génotypage (Analyse de fragments, marqueurs microsatellite)

 Génotypage Quantité
Vous envoyez au laboratoire :
Format d'expédition / commentaires

Echantillons traités dans votre laboratoire

 Par multiple de 48

Plaque 96 puits :

10 µl réactions de séquence purifiées

Plaque 384 puits :

5 µl réactions de séquence purifiées

Plaques 96 et 384 puits: Applied Biosystems MicroAmp TM optical


La Formamide utilisée doit impérativement être de qualité Hi-Di

 Dyes utilisés sur la Plate-forme filtreF( DS-32), 5-Fam. JOE. NED.ROX
  filtreD(DS-30), 6-FAM.HEX.NED.ROX
  filtreE(DS-02),dR110.dR6G.dTAMRA.dROX.LIZ
  filtreG5(DS-33), 6-FAM.VIC.NED.PET.LIZ
                                                            

Tous les puits de la plaque doivent  contenir une solution avant injection capillaire. Les puits vides sont à remplir avec de l'eau.

  • Pour la réalisation de votre première feuille de route de génotypage veuillez contacter le personnel de la plate-forme.